?

基于PI3K/mTOR通路益氣化瘀解毒方對人肝癌細胞SMCC-7721自噬流的影響

2019-11-15 12:11:50 中國中醫藥信息雜志 2019年10期

張振 郜文輝 田雪飛 陳思勤 何鳳姣 周芳 王亞琪 朱洪兵 李克雄 曾普華

摘要:目的? 觀察益氣化瘀解毒方對人肝癌細胞SMCC-7721自噬流的影響,初步探討其可能的作用機制。方法? 實驗分為空白對照組、重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組、雷帕霉素組及索拉非尼組,各給藥組給予相應藥物。體外實驗觀察人肝癌細胞SMCC-7721自噬流發生情況并檢測細胞微管相關蛋白1輕鏈3(LC-3Ⅱ)、類胰島素樣生長因子2的mRNA結合蛋白質(p62)及磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表達。結果? 重樓皂苷Ⅰ、益氣化瘀解毒方及索拉非尼均能阻斷人肝癌細胞SMCC-7721自噬流,導致細胞內自噬小體的蓄積,上調LC-3Ⅱ、p62的表達,同時可下調PI3K、mTOR蛋白的表達。結論? 益氣化瘀解毒方可改變人肝癌細胞SMCC-7721形態;重樓皂苷Ⅰ、益氣化瘀解毒方及索拉非尼均能阻斷人肝癌細胞SMCC-7721自噬流,增加自噬體數量,其機制可能與抑制PI3K/mTOR信號通路有關。

關鍵詞:益氣化瘀解毒方;自噬流;人肝癌細胞SMCC-7721

中圖分類號:R285.5??? 文獻標識碼:A??? 文章編號:1005-5304(2019)10-0045-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.011????? 開放科學(資源服務)標識碼(OSID):

Abstract: Objective To observe the effects of Yiqi Huayu Jiedu Prescription on autophagy flow of human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721; To preliminarily discuss its possible mechanism of action. Methods The experiment was divided into blank control group, Chonglou saponin Ⅰ group, Yiqi Huayu Jiedu Prescription group, Rapamycin group and Sorafenib group. Each administration group was given relevant medicine. In vitro experiments were performed to observe the occurrence of autophagy flow in human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721 and to detect the expressions of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC-3Ⅱ), insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein (p62) and phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), mammalian target of Rapamycin (mTOR). Results Chonglou Saponins Ⅰ, Yiqi Huayu Jiedu Prescription and Sorafenib could block the autophagy flow of human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721, leading to the accumulation of autophagic bodies in cells and up-regulating the expression of LC-3Ⅱ and p62. The expressions of PI3K and mTOR protein could be down-regulated. Conclusion Yiqi Huayu Jiedu Prescription can change cell morphology of SMCC-7721; Chonglou saponins Ⅰ, Yiqi Huayu Jiedu Prescription, and sorafenib can block the autophagy flow of SMCC-7721 and increase the number of autophagic bodies, which may be related to the PI3K/mTOR signal pathway.

Keywords: Yiqi Huayu Jiedu Prescription; autophagy flow; human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721

據統計,原發性肝癌發病率在惡性腫瘤中居第6位,死亡率居第4位,我國肝癌患者死亡人數占全球一半以上[1]。中醫藥資源豐富,是治療原發性肝癌的手段之一,長期服用毒副作用低[2]。有研究表明,中藥在抑制血管新生、抗凋亡、調節免疫及改善生活質量等方面發揮了重要的作用[3-4]。益氣化瘀解毒方是全國名中醫潘敏求教授治療肝癌效驗方。我們前期研究發現,其可下調人肝癌細胞CXCL12/CXCR4/ CXCR7趨化因子軸,抑制細胞增殖及遷移,同時能降低肝癌裸鼠移植瘤血管密度(MVD),抑制低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)的表達,從而發揮抗腫瘤作用[5-10]。下調HIF-1α能通過多種途徑促進VEGF的表達,VEGF是PI3K/mTOR信號通路上游的關鍵靶點之一,且PI3K/mTOR信號通路是參與細胞自噬的經典途徑之一。因此,在前期實驗的基礎上,本研究以PI3K/mTOR信號通路介導肝癌細胞自噬性死亡為可能機制,進一步探討益氣化瘀解毒方抗腫瘤的作用途徑,為開發抗肝癌多靶點的中藥新藥提供依據。

1? 實驗材料

1.1? 細胞

人肝癌細胞SMCC-7721,武漢博士德生物工程有限公司。

1.2? 藥物

益氣化瘀解毒方(黃芪30 g,白參10 g,半枝蓮 30 g,醋莪術15 g,甘草5 g),飲片均購自湖南中醫藥大學附屬第一醫院中藥房;索拉非尼,南通飛宇生物科技有限公司,批號FY34720409,20 mg/支,含量≥98%;重樓皂苷Ⅰ,南通飛宇生物科技有限公司,批號FY11010222,50 mg/支,含量≥98%;雷帕霉素,南通飛宇生物科技有限公司,批號FY3415RKR089,20 mg/支,含量≥98%。

1.3? 主要試劑與儀器

雙抗(青霉素-鏈霉素)、胎牛血清、PBS、DMEM和胰蛋白酶,Gibco公司;細胞凍存液,天津灝洋;mGFP-RFP-LC3(LC3自噬雙標腺病毒),漢恒生物;一抗,Abcam公司;BSA,華美公司;PVDF膜,Amersham公司,HRP偶聯山羊抗鼠、兔IgG,Sigma公司。0.22 mm移液槍(Gilson),細菌濾器(Millipore),無菌盒裝吸頭(Axygen),一次性離心管(Corning),細胞培養皿(Nest biotechology),細胞培養板(Costar),巴氏吸管(武漢博士德),氨基載玻片(天津灝洋),爬片(SORFA),培養瓶(Corning),超凈工作臺(SW-CJ-1FD,蘇州蘇潔凈化設備有限公司),離心機(TD5A,長沙英泰儀器有限公司),倒置顯微鏡(XDS-1B,重慶光電北京有限公司),恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司),水浴箱(上海一恒科技有限公司),共聚焦顯微鏡(FV1000,日本Olympus)。

2? 實驗方法

2.1? 細胞培養

將人肝癌細胞SMCC-7721接種于高糖培養液中(含10%胎牛血清),置于90%N2-5%CO2-5%O2培養箱培養。

2.2? 藥物制備

將益氣化瘀解毒方飲片煎煮并濃縮至每1 mL含1 g原藥材,濾紙粗濾,將藥物按一定比例配制成含中藥的DMEM溶液。使用前將藥液分別稀釋至5 g/L。重樓皂苷Ⅰ:將50 mg樣品溶于0.25 mL DMSO中配制成母液,并將母液溶于DMEM,配制成50 mg/L。索拉非尼:將200 mg樣品溶于DMSO,再將溶有索拉非尼的DMSO溶于DMEM,配制成6 μmol/L溶液。雷帕霉素:將20 mg雷帕霉素溶于DMSO,再將溶有雷帕霉素的DMSO溶于DMEM,配制成4 μmol/L溶液。

2.3? 分組和給藥

實驗分為益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷Ⅰ組、雷帕霉素組、索拉非尼組和空白對照組。每孔加入已配制好的藥液2 mL,干預24 h。

2.4? 免疫熒光檢測

取貼壁對數生長期的細胞,加入配制好的腺病毒(1 μL腺病毒∶1 mL DMEM)1 mL,置于培養箱中培養6 h后加入藥物干預,24 h后,加入預冷多聚甲醛2 mL,室溫靜置10 min;用吸水紙吸干,滴入熒光淬滅劑封片,在熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.5? Western blot檢測

取5×104/mL對數生長期細胞2 mL接種至6孔板,藥物干預24 h后,根據RIPA蛋白抽提試劑說明提取各組蛋白,BCA法測定各組細胞總蛋白,各組取等量蛋白。然后按樣品∶上樣緩沖液=4∶1比例加入上樣緩沖液并混合均勻,100 ℃水浴10 min,之后置于冰上5 min,加入上樣緩沖液煮沸3 min,經SDS-PAGE電泳,轉膜,加一抗稀釋液(LC3、p62、PI3K、mTOR)并將二抗稀釋至1∶3000,室溫孵育1 h,洗膜,化學發光法,曝光,顯影,定影,拍照。用Image J進行灰度分析,并以β-actin作為內參。實驗獨立重復3次。

3? 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。計量資料以 —x±s表示,多組均數間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 益氣化瘀解毒方對人肝癌細胞SMCC-7721自噬流的影響

共聚焦顯微鏡下自噬小體顯示為紅色熒光蛋白(RFP)與綠色熒光蛋白(GFP)merge后的黃色熒光。由于GFP遇酸會發生淬滅,因此,自噬溶酶體在熒光顯微鏡下顯示為紅色斑點。與空白對照組比較,益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷Ⅰ組及索拉非尼組人肝癌細胞SMCC-7721細胞自噬流均明顯受阻,導致細胞自噬小體蓄積,益氣化瘀解毒方組與重樓皂苷Ⅰ組比較差異無統計學意義(P>0.05),但與索拉非尼組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

4.2? 益氣化瘀解毒方對人肝癌細胞SMCC-7721自噬相關蛋白LC3Ⅱ及p62蛋白表達的影響

與空白對照組比較,重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組及索拉非尼組均能上調自噬相關蛋白LC3Ⅱ及p62的表達,差異有統計學意義(P<0.05);與雷帕霉素組比較,重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組及索拉非尼組均能下調自噬相關蛋白LC3Ⅱ及p62的表達,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、圖3。

4.3? 益氣化瘀解毒方對人肝癌細胞SMCC-7721自噬相關通路PI3K/mTOR蛋白表達的影響

與空白對照組比較,重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組和索拉非尼組均能下調PI3K、mTOR的表達,差異有統計學意義(P<0.05);與雷帕霉素組比較,重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組和索拉非尼組均能上調PI3K、mTOR的表達,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、圖5。

5? 討論

全國名老中醫潘敏求教授結合其多年臨床經驗,將肝癌病因病機總結歸納為“虛”“毒”“瘀”:肝癌患者常見脘腹脹滿、神疲乏力、消瘦、納呆、大便溏結等為“脾虛”之癥;肝癌病情復雜、發展變化快、預后差,常合并肝炎、肝硬化等病史,同時多種病理因素夾雜,這些均屬中醫學“毒”或“癌毒”范疇;肝癌常見的上腹腫塊及肝區固定疼痛等,是“瘀”的客觀表現。癌乃“因虛致癌”,先有正氣不足,而后受外來“邪毒”侵襲,導致毒瘀互結而成,癌變進一步發展使正氣更虛,從而又表現出“因癌致虛”的現象,血瘀、邪毒、正氣虛三者始終并存,互為因果,惡性循環,貫穿于肝癌整個病程。潘老在此基礎上提出,“健脾理氣、化瘀軟堅、清熱解毒”為肝癌基本治法,并擬定益氣化瘀解毒方為治療肝癌基礎方。方中重用黃芪、白參,取其健脾益氣、扶正固表之功,并以醋莪術化瘀止痛,半枝蓮清熱解毒,甘草調和諸藥,全方共奏益氣化瘀、清熱解毒之效。

自噬是一把雙刃劍,根據細胞環境和功能狀態的不同,自噬可提高細胞活力,或誘導細胞程序性死亡[11]。細胞自噬是一個動態過程,自噬體形成增加及自噬溶酶體降解過程被阻斷,均可使自噬小體蓄積,導致細胞死亡[12]。LC3是一種泛素樣蛋白,與自噬體的表達有密切關系,在細胞中以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ形式存在,其中LC3Ⅱ主要存在于自噬體膜上,而LC3Ⅰ定位于細胞質中。LC3Ⅱ對于自噬體的形成起決定性作用,細胞去除LC3Ⅱ后,無法形成完整的自噬小體。而且LC3Ⅱ表達的多少與自噬體數量呈一一對應關系,因而成為應用最為廣泛的細胞自噬體標記物之一。LC3Ⅱ的高表達表明自噬小體數量的蓄積。p62具有多重作用,在自噬體和溶酶體結合過程中,為溶酶體提供供體,并引導自噬體與溶酶體結合,是自噬體降解過程中的一種選擇性底物蛋白。p62的下調表明自噬流被活化,而p62的上調則表明自噬流被阻斷。

PI3K/mTOR信號通路是細胞中關鍵的復興自噬調節信號通路。有研究表明,PI3K/mTOR信號通路的上調可促進腫瘤的惡化[13]。PI3K是普遍存在于細胞質中的一種蛋白激酶。細胞中的多種生長因子,如HIF-1α,可激活細胞中的酪氨酸激酶,從而激活PI3K。PI3K激活后把PIP2轉化為PIP3,PI3P對自噬囊泡的形成起到了至關重要的作用。生成的PIP3作用于下游信號分子蛋白激酶B(Akt),導致Akt構象改變,使Akt激活。Akt激活后可直接激活下游信號分子mTOR。mTOR是PI3K家族中的成員之一,在細胞自噬過程中起著重要作用。

本研究結果表明,重樓皂苷Ⅰ、益氣化瘀解毒方及索拉非尼均能抑制細胞自噬流,導致細胞自噬小體蓄積,使細胞損傷死亡,產生抗腫瘤作用,且益氣化瘀解毒方中活性成分可能是重樓皂苷Ⅰ,其機制可能與下調PI3K、mTOR蛋白的表達有關。

參考文獻:

[1] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2018[J]. Ca A Cancer Journal for Clinicians,2018,60(5):277-300.

[2] 姜濤,唐軍,呂媛琳,等.從腫瘤糖代謝探討中醫藥抗癌策略[J].中醫雜志,2018,59(7):569-572.

[3] 方子寒,漆仲文,謝盈彧,等.中藥對斑馬魚血管新生干預作用的研究進展[J].中草藥,2018,49(14):3441-3445.

[4] 王菁雯,何萍,胡兵,等.中醫藥調控胃癌細胞凋亡作用機制[J].中醫藥學報,2018,46(2):110-115.

[5] 曾普華,郜文輝,潘敏求,等.益氣化瘀解毒方對人肝癌裸鼠HepG2移植瘤MVD、HIF1a、VEGF/KDR表達的影響[J].中華中醫藥學刊,2014,32(7):1563-1565.

[6] 曾普華,郜文輝,潘敏求,等.益氣化瘀解毒方及拆方對人肝癌HepG2裸鼠移植瘤和HIF1α、E-cad表達的影響[J].遼寧中醫雜志,2014,9(12):2004-2006.

[7] 郜文輝,曾普華,潘敏求,等.益氣化瘀解毒方含藥血清對雞胚尿囊膜血管生成的影響[J].中華中醫藥學刊,2013,31(1):19-20.

[8] 曾普華,郜文輝,潘敏求,等.益氣化瘀解毒方藥對人肝癌HepG2細胞增殖和裸鼠移植瘤生長的影響[J].現代腫瘤醫學,2014,22(1):8-11.

[9] 曾普華,郜文輝,潘敏求,等.益氣化瘀解毒方及其單味藥對人肝癌HepG2裸鼠移植瘤血管擬態相關因子的影響[J].中國中醫藥信息雜志, 2015,22(2):55-59.

[10] 郜文輝,曾普華,黃惠勇,等.益氣化瘀解毒方對人肝癌細胞MHCC97-H遷移能力及趨化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2018,25(7):41-43.

[11] GIMENEZXAVIER P, FRANCISCO R, SANTIDRIAN A F, et al. Effects of dopamine on LC3-Ⅱ activation as a marker of autophagy in a neuroblastoma cell model[J]. Neurotoxicology,2009,30(4):658-665.

[12] ZHU W, PAN X, LI F, et al. Expression of Beclin 1 and LC3 in FIGO stage Ⅰ–Ⅱ cervical squamous cell carcinoma and relationship to survival[J]. Tumour Biol,2012,33(5):1653-1659.

[13] TANIDA I, Ueno T, KOMINAMI E, et al. LC3 conjugation system in mammalian autophagy[J]. Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2503-2518.

(收稿日期:2019-03-25)

(修回日期:2019-04-16;編輯:華強)

?
(function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();
重庆实时走势图5星综合 北京兼职外卖赚钱吗 dota魅惑魔女 十一运夺金杀号 今日头条作者怎们赚钱 农民工做什么赚钱 AG日本武士开奖数据 甘肃11选5开奖记录 用电脑给手机下载软件赚钱的软件 现在到底是做什么赚钱 梦幻西游175龙宫挂机卖f赚钱 天龙内测服怎么赚钱 金牛棋牌安卓版下载 手机时时彩开奖结果 云南十一选五计划 适合学生党赚钱的方法有哪些 981游戏中心官方下载